Sous-réseaux distincts du noyau réticulaire thalamiqu

Sous-réseaux distincts du noyau réticulaire thalamiqu

juli 22, 2020 0 Door admin

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Abstract

The thalamic reticular nucleus (TRN), the major source of thalamic inhibition, regulates thalamocortical interactions that are critical for sensory processing, attention and cognition1,2,3,4,5. TRN dysfunction has been linked to sensory abnormality, attention deficit and sleep disturbance across multiple neurodevelopmental disorders6,7,8,9. However, little is known about the organizational principles that underlie its divergent functions. Here we performed an integrative study linking single-cell molecular and electrophysiological features of the mouse TRN to connectivity and systems-level function. We found that cellular heterogeneity in the TRN is characterized by a transcriptomic gradient of two negatively correlated gene-expression profiles, each containing hundreds of genes. Neurons in the extremes of this transcriptomic gradient express mutually exclusive markers, exhibit core or shell-like anatomical structure and have distinct electrophysiological properties. The two TRN subpopulations make differential connections with the functionally distinct first-order and higher-order thalamic nuclei to form molecularly defined TRN–thalamus subnetworks. Selective perturbation of the two subnetworks in vivo revealed their differential role in regulating sleep. In sum, our study provides a comprehensive atlas of TRN neurons at single-cell resolution and links molecularly defined subnetworks to the functional organization of thalamocortical circuits.

Data availability

Sequencing data for this study is available through the Gene Expression Omnibus GSE145273. All additional data, and plasmids are available from the authors upon reasonable request.

Code availability

Code for the snRNA-seq analyses and the associated t-SNE mappings are available at https://github.com/yinqingl. Any additional code used is available from the authors upon reasonable request.

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Remerciements

Nous remercions tous les membres du GF, ZF et J.Z.L. laboratoires d’échanges et de soutien; R. Kast pour ses commentaires utiles sur ce manuscrit; M. Fleishman et M. Palomero-Rivero pour le soutien technique; le Broad Flow Cytometry Facility pour le tri des noyaux; et F. Zhang pour les constructions CRISPR – Cas9. Les travaux au laboratoire de G.F. a été soutenu par le Simons Center for the Social Brain du MIT, le Stanley Center for Psychiatric Research au Broad Institute of MIT et Harvard, le Hock E. Tan et le K. Lisa Yang Center for Autism Research au MIT, le James and Patricia Poitras Center for Recherche sur les troubles psychiatriques au MIT, l’Institut McGovern pour la recherche sur le cerveau du MIT et les subventions NIH / NIMH R01NS098505, R01NS113245. Le travail dans le laboratoire de Z.F. a été soutenu par le Stanley Center for Psychiatric Research du Broad Institute du MIT et de Harvard. Les travaux dans le laboratoire de J.Z.L. a été soutenu par le Stanley Center for Psychiatric Research et le Klarman Cell Observatory du Broad Institute du MIT et de Harvard. Les travaux au laboratoire de M.M.H. a été soutenu par le Simons Center for the Social Brain du MIT, le Stanley Center for Psychiatric Research du Broad Institute, le McGovern Institute for Brain Research au MIT, la Pew Foundation, le Human Frontiers Science Program et les subventions NIH R01NS098505, R01MH107680. Y.L. a été soutenu par l’Institut McGovern-IDG pour la recherche sur le cerveau de l’Université Tsinghua.

Informations sur l’auteur

Notes sur l’auteur

  1. Ces auteurs ont contribué à parts égales: Yinqing Li, Violeta G. Lopez-Huerta, Xian Adiconis

  2. Ces auteurs ont conjointement supervisé ce travail: Joshua Z. Levin, Zhanyan Fu, Guoping Feng

Affiliations

  1. École des sciences pharmaceutiques, Institut IDG / McGovern pour la recherche sur le cerveau, Centre de biologie synthétique et des systèmes, Université Tsinghua, Pékin, République populaire de Chine

    Yinqing Li

  2. The Stanley Center for Psychiatric Research, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA, USA

    Yinqing Li, Violeta G. Lopez-Huerta, Xian Adiconis, Kirsten Levandowski, Soonwook Choi, Sean K. Simmons, Mario A. Arias-Garcia, Baolin Guo, Annie Y. Yao, Timothy R. Blosser, Tomomi Aida, Alexander Atamian, Tina Naik, Diya Malhotra, Cynthia C. Hession, Reut Shema, Taibo Li, Joshua Z. Levin, Zhanyan Fu et Guoping Feng

  3. McGovern Institute for Brain Research and the Department of Brain and Cognitive Sciences, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, États-Unis

    Yinqing Li, Violeta G. Lopez-Huerta, Kirsten Levandowski, Soonwook Choi, Mario A. Arias-Garcia, Baolin Guo, Annie Y. Yao, Timothy R. Blosser, Ralf D. Wimmer , Tomomi Aida, Alexander Atamian, Tina Naik, Xuyun Sun, Dasheng Bi, Diya Malhotra, Reut Shema, Marcos Gomes, Taibo Li, Alexandra Krol, Michael M. Halassa, Zhanyan Fu et Guoping Feng

  4. Institut de physiologie cellulaire, Université nationale autonome du Mexique, Mexico, Mexique

    Violeta G. Lopez-Huerta

  5. Observatoire des cellules du Klarman, Broad Institute of MIT et Harvard, Cambridge, MA, USA

    Xian Adiconis, Sean K. Simmons, Cynthia C. Hession, Monika Kowalczyk & Joshua Z. Levin

  6. Faculté de psychologie, Université nationale autonome de Mexico, Mexico, Mexique

    Mario A. Arias-Garcia

  7. Collège d’informatique et Technologie, Université du Zhejiang, Hangzhou, RP Chine

    Xuyun Sun & Gang Pan

  8. Université de Coimbra, Centre de neurosciences et de biologie cellulaire , Coimbra, Portugal

    Marcos Gomes & João Peça

  9. Université de Coimbra, Institut de recherche interdisciplinaire, Coimbra, Portugal p >

    Marcos Gomes & João Peça

  10. Center for Neuroscience, Korea Institute of Science and Technology, Séoul, Corée du Sud

    Eunjin Hwang

  11. Université de Coimbra, Département des sciences de la vie, Coimbra, Portugal

    João Peça

Contributions

YL, VGL-H., JZL, ZF et G.F. a assuré la conception globale et la supervision du projet. Les expériences snRNA-seq ont été conçues, réalisées, analysées ou supervisées par Y.L., V.G.L.-H., X.A., C.C.H., S.K.S. et T.L. Un protocole modifié pour la construction de la bibliothèque Smart-seq2 a été fourni par M.K. Les injections virales et la collecte de noyaux neuronaux non-TRN Pvalb ont été réalisées par R.S. et V.G.L.-H. Les expériences RNA FISH ont été conçues, réalisées, analysées ou supervisées par Y.L., K.L., A.Y.Y., T.R.B., A.A., M.G. et J.P. Les enregistrements et analyses EEG ont été conçus et réalisés par S.C., R.D.W., V.G.L.-H., B.G., T.N., X.S., D.B., E.H., G.P. et M.M.H. Des expériences d’électrophysiologie, de patch – seq et de morphologie ont été conçues, réalisées, analysées ou supervisées par V.G.L.-H., M.A.A.-G., Y.L. et Z.F. Des expériences de traçage rétrograde ont été réalisées par V.G.L.-H., Y.L., A.Y.Y., A.A., K.L. et A.K. Les expériences CRISPR-knockout ont été conçues et réalisées par Y.L., V.G.L.-H., X.A., T.A., A.Y.Y., A.A. et D.M. Le manuscrit a été écrit par Y.L., V.G.L.-H., Z.F., G.F., J.Z.L. et M.M.H. avec les contributions de tous les auteurs.

Auteurs correspondants

Correspondance avec Joshua Z. Levin ou Zhanyan Fu ou Guoping Feng .

Déclarations éthiques

Intérêts concurrents

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Informations supplémentaires h2>

Informations sur l’examen par les pairs Nature remercie Ed S. Lein, Karel Svoboda et l’autre, anonyme, évaluateur (s) pour leur contribution à l’examen par les pairs de ce travail.

Note de l’éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Chiffres et tableaux de données étendues

Données étendues Fig. 1 Modèles d’expression de Gad2 et Pvalb à travers TRN.

a , Schéma des positions des coupes coronales le long de la partie antérieure à postérieure axe (indiqué par des nombres). b d , co-coloration ARN-FISH de Gad2 et Pvalb en partie antérieure ( b ), coupes coronales médiales ( c ) et postérieures ( d ). Pour chaque position: à gauche: aperçu de la co-coloration ARN-FISH dans TRN; Droite: vue agrandie de la zone encadrée dans le panneau de gauche. Pour b d , répété avec n = 2. e , graphique FACS représentatif montrant la stratégie de porte utilisée dans le tri noyaux uniques pour le séquençage de l’ARN. Répété avec n = 53 tri basé sur les plaques.

Données étendues Fig. 2 Identification des types de cellules Gad2 .

a , t -SNE incrustation de 1 687 noyaux simples comme sur la Fig. 1a . Les noyaux uniques sont colorés par des sources de dissection comme indiqué par la barre de couleur sur la droite. Différents lots de dissections de la partie externe du globus pallidus (GPE) sont colorés différemment. n = 1 687 noyaux. b , t -SNE incrustation de noyaux montrant les niveaux d’expression (pseudo-couleur) des gènes marqueurs pour chaque cluster. Les trois petits clusters présentant nettement moins d’expression Pvalb , mais enrichis d’une combinaison de marqueurs dont Gabra1 , Fxyd6 , Tac1 i >. n = 868 noyaux. c , image ISH en vue sagittale des marqueurs sélectionnés indiqués en b . Images obtenues à partir d’Allen Brain Atlas ( https://portal.brain-map.org/ ). Les lignes pointillées indiquent les limites de TRN et des noyaux GABAergiques voisins. GP: globus pallidus; ZI: zona incerta; BNST: noyau du lit de la strie terminale.

Données étendues Fig. 3 Modèle d’expression binarisé de Spp1 et Ecel1 représente un gradient transcriptomique.

a , Niveaux d’expression de Spp1 et Ecel1 (en haut) et log ( Spp1 / Ecel1 ) (en bas) dans des cellules individuelles le long du gradient transcriptomique, montrant le modèle binaire de Spp1 et Ecel1 en corrélation avec le score du gradient. b , Nombre de gènes détectés pour les principaux types de cellules et sous-populations TRN, montrant que le Spp1 Ecel1 (DP) et Spp1Ecel1 (DN) sont de qualité comparable à d’autres populations de cellules. n ASC = 124, n Glut = 226, n GABA = 868, n ODC = 388, nGad1 Cck = 9, n OPC = 23, n MCG = 28, nEbf2 sup> = 21 noyaux. Entre Spp1 et DP, P = 0,1787; DN et Ecel1 , P = 0.2897, test de somme de rang bilatéral. n.s.: non significatif. Aucun ajustement pour les tests multiples n’était applicable. Les boîtes à moustaches indiquent les 25e, 50e et 75e centiles, et les moustaches s’étendent jusqu’aux points de données les plus extrêmes, « » sont considérés comme des valeurs aberrantes. c , Schémas de classificateurs Bayes naïfs pour attribuer Spp1 , Ecel1 , Neurones DP et DN en segments du gradient transcriptomique. d , Précision de classification des classificateurs naïfs de Bayes. La probabilité d’affecter Spp1 au segment ‘Spp1’, les neurones DP et DN au segment intermédiaire et Ecel1 au segment «Ecel1», respectivement. n = 671 noyaux au total, nSpp1 = 264, n DP DN = 195, nEcel1 = 212 neurones. e , Schémas de normalisation de la position médio-latérale des neurones individuels dans les images FISH. Ligne bleue: limite TRN; Points rouges: neurones Pvalb Spp1 ; Points verts: neurones Pvalb Ecel1 ; Points jaunes: neurones DP; Les DN ne sont pas affichés dans les schémas. f , Nuages ​​de points montrant le log ( Spp1 / Ecel1 ) dans l’individu Pvalb neurones en position médiale-latérale normalisée dans des images tFISH sélectionnées le long de la TRN antérieure à postérieure, correspondant à la Fig. 2c . m-l: position médiale-latérale; Points bleus: cellules individuelles; Ligne rouge continue: ajustement fluide des points de données bleus, montrant la forme en «U» inversé; Ligne bleue en pointillés: moyenne des points de données bleus, indiquant la différence de fond FISH des canaux Spp1 et Ecel1 dans différentes images.

Données étendues Fig. 4 Sites d’injection dans des noyaux relais thalamiques distincts et projections corticales correspondantes. a>

a , Les positions des neurones marqués rétrogradement tracés à partir de différents noyaux relais thalamiques indiqués par différentes couleurs sont montrées dans la vue coronale de la série de coupes TRN disposées de l’avant vers l’arrière. Le vert clair et les zones ombrées magenta indiquent la distribution des neurones typiques Ecel1 et Spp1 , respectivement. VPM, ventrale postérieure médiale; dLGN, noyau géniculé latéral (partie dorsale); POm, postéro-médial; LP, partie latérale postéro-latérale; dMGN, partie géniculée-dorsale médiale; vMGN, partie géniculée-ventrale médiale; VM, ventromédial; VL, ventrolatéral. n = 3 souris par région. b , vue panoramique des coupes coronales montrant les sites d’injection et la projection corticale pour chaque noyau thalamique FO et HO. V1: cortex visuel primaire; V2L: partie latérale du cortex visuel secondaire; V2ML: partie médio-latérale du cortex visuel secondaire; S1BF: champ baril primaire du cortex somatosensoriel; S1DZ: zones dysgranulaires primaires du cortex somatosensoriel; S1FL: membre antérieur du cortex somatosensoriel primaire; S1HL: membre postérieur du cortex somatosensoriel primaire; S2: cortex somatosensoriel secondaire; AuV: région ventrale du cortex auditif secondaire; Au1: cortex auditif primaire; AuD: zone dorsale du cortex auditif secondaire; MGD: partie dorsale des noyaux géniculés médiaux; MGM: partie médiale des noyaux géniculés médiaux; TeA: cortex temporal, aire d’association. n = 3 souris par région. c , quantification du rapport de projection entre les aires corticales primaire et secondaire / tertiaire d’ordre supérieur pour différents sites d’injection thalamiques. n dLGN = 12 tranches / 2 souris, n LP = 12 tranches / 2 souris, n MGV = 15 tranches / 2 souris, n MGD / MGM = 12 tranches / 2 souris, n i> VPM = 12 tranches / 2 souris, n POm = 12 tranches / 2 souris. Les barres représentent la moyenne ± s.e.m. et des points de données brutes.

Données étendues Fig. 5 Distribution des neurones TRN selon le score de gradient moléculaire.

a , La distribution anatomique des neurones enregistrés par Patch-seq dans les coupes coronales de TRN le long de la partie antérieure-postérieure axe. Les cellules ont été étiquetées avec des numéros de couleur différents comme indiqué ( Spp1 , magenta, Ecel1 , vert, DP , noir et DN, bleu). Les nombres indiquent l’ID de la cellule. Montré sont n = 76 cellules / 5 souris, données collectées par 2 expérimentateurs. b , intégration biSNE des neurones TRN collectés pour Patch-seq montrant un modèle de gradient moléculaire avec Spp1 ( magenta), Ecel1 (vert), et les sous-populations intermédiaires DP (bleu) et DN (noir). Un sous-ensemble de neurones d’un lot de n = 68 neurones / 5 souris est illustré. c , changements de tension représentatifs en réponse à des injections de pas de courant hyperpolarisantes. Les neurones Spp1 (magenta) montrent des explosions de rebond robustes provoquées par une hyperpolarisation avec des fréquences de déclenchement élevées dans une rafale. Lorsqu’un protocole similaire est appliqué, la plupart des neurones Ecel1 (vert) affichent une seule rafale de rebond avec des fréquences de déclenchement plus faibles dans une rafale que Spp1 i > neurones. Les neurones DN (bleu) et DP (noir) présentent des propriétés intermédiaires. nEcel1 = 15, n Spp1 = 29, n DN = 9 , n DP = 10 neurones.

Données étendues Fig. 6 Les neurones TRN présentent des différences de propriétés de potentiel d’action et de morphologie.

a , Zoom- en vue d’une simple action représentative des traces potentielles des neurones Spp 1 et Ecel1 . b , Résumé du seuil de potentiel d’action (PA) ( P = 0,015, test t non apparié bilatéral) et demi-largeur de PA (APhw) ( P = 7,08 × 10 5 , test t non apparié recto-verso). Pour a , b , n Spp1 = 12, n Ecel1 = 13, n DP = 6, n DN = 7 neurones de 5 souris. Les graphiques représentent la moyenne ± s.d. et les points de données brutes. c , Exemple de Spp1 comme (‘Spp1’) (magenta) et Ecel1 comme la morphologie des neurones (‘Ecel1’) (vert). d , analyse Sholl de la complexité dendritique. e , Résumé de la longueur et de la largeur du soma, de la longueur dendritique totale et du nombre maximum d’intersections dans Spp1 comme (‘Spp1’) et Ecel1 neurones comme (‘Ecel1’) (Moyenne ± sd Longueur dendritique, P = 0,0014. Nombre d’intersections, P i> = 0,0004, test t non apparié recto-verso). Pour c e , n ‘Spp1’ = 11 neurones / 4 souris, n i> ‘Ecel1’ = 10 neurones / 4 souris.

Données étendues Fig. 7 Criblage CRISPR in vivo groupé médié par l’AAV.

a , Schémas de l’AAV médié criblage in vivo CRISPR – Cas9 groupé. b , Liste des pools et gènes sélectionnés pour knock-out dans le criblage CRISPR – Cas9. TRN enrichi fait référence à des gènes différentiellement exprimés entre les neurones Pvalb du TRN et du cortex M2, du cortex somatosensoriel, du striatum et de l’hippocampe. c , une carte thermique montrant le modèle d’expression des gènes sélectionnés dans les neurones TRN. Les gènes de risque de maladie sélectionnés sont étiquetés sur le côté droit. d , une carte thermique montrant les gènes de risque de maladie exprimés de manière différentielle dans Spp1 versus Ecel1 neurones: trouble du spectre autistique (TSA, violet) et schizophrénie (orange). e , graphiques Violin montrant une liste de gènes différentiellement exprimés entre les neurones Pvalb dans TRN comparés et Pvalb neurones dans les quatre autres régions du cerveau, y compris l’hippocampe (HP), le cortex moteur secondaire (M2), le cortex somatosensoriel (SCX) et le striatum (STR). f , graphiques Violin confirmant la liste des gènes enrichis en TRN comme indiqué dans e dans des régions cérébrales supplémentaires en utilisant les ensembles de données mousebrain.org. CB: cervelet; Hypoth: hypothalamus; MBd: partie dorsale du noyau basal médial; MBV: partie ventrale du noyau basal médial; SC: moelle épinière; Thal: thalamus. g , graphiques violon montrant des gènes de risque de maladie exprimés différentiellement par rapport aux neurones Pvalb dans les quatre autres régions du cerveau, comme indiqué. HP: hippocampe; M2: cortex moteur secondaire; SCX: cortex somatosensoriel; STR: striatum. Pour e et g , n HP = 90, n M2 = 97, n SCX = 116, n STR = 13, n TRN = 671 cellules; Pour (f), n CA1 = 136, n CB = 477, n i > Hypothèse = 156, n MBb = 331, n MBv = 209, n Medulla = 121, n Pons = 199, n SC = 69, n Thal = 54, n TRN = 501 cellules. La largeur des tracés de violon est basée sur une estimation de la densité du noyau gaussien des données (estimée par la fonction de densité standard dans R avec les paramètres par défaut), mise à l’échelle pour avoir une largeur maximale égale à 1.

Données étendues Fig. 8 Le criblage CRISPR-Cas9 in vivo mis en commun révèle des ensembles de gènes contribuant à l’éclatement du TRN properties.

a , Traces d’enregistrement représentatives de la pince de courant de Spp1 comme (‘Spp1’ , magenta) et Ecel1 comme (‘Ecel1’, vert) neurones maintenus à différents potentiels membranaires. La trace avec le nombre maximal de rafales a été sélectionnée pour mesurer différentes propriétés de rafale et calculer le score Z (illustré à droite). b , tracé montrant les ellipses d’intervalle de confiance pour classer Spp1 comme (‘Spp1’) et Ecel1 comme les neurones (‘Ecel1’) basés sur l’AHP et le nombre de rafales de rebond. c , Traces de rebond représentatives de rafale de neurones enregistrés après avoir éliminé différents ensembles de gènes via l’édition de gène CRISPR – Cas9. Les traces montrent des changements d’activité d’éclatement de rebond en réponse aux injections de pas de courant hyperpolarisantes. Les neurones TRN ont présenté des changements distincts dans leurs schémas de déclenchement après knock-out de différents groupes de gènes. d , tracés radar de 5 paramètres électrophysiologiques illustrés en a , montrant la déviation du groupe perturbé par rapport au contrôle après avoir éliminé des ensembles de gènes dans l’approche groupée. Les changements positifs montrent une augmentation vers un paramètre, tandis que les changements négatifs montrent une diminution par rapport au contrôle. La ligne verte indique les écarts dans Ecel1 comme les neurones et les nuances de couleur indiquent les écarts dans Spp1 comme les neurones. e , Résumé du nombre maximal de rafales de rebond des neurones TRN provoqués par une injection de pas de courant hyperpolarisant comparable comme décrit dans la Fig. 4b après que différents ensembles de gènes ont été éliminés l’approche mutualisée dans Spp1 comme (‘Spp1’) vs Ecel1 comme (‘Ecel1’) neurones (‘Spp1’ Pool1, P = 4.8742 × 10 7 ; Pool3, P i > = 0,0033; Pool5, P = 0,0088; Pool7, P = 0,0065. ‘Ecel1’ Pool3, P = 0,0081; Pool7, P = 0,023, test t non apparié recto-verso). Les barres représentent la moyenne ± s.e.m. Pour a e : ‘Spp1’ Ighe n = 12, Pool1 n = 12, Pool2 n = 9, Pool3 n = 13, Pool4 n = 9, Pool5 n = 10, Pool6 n = 9 et Pool7 n = 10 cellules; ‘Ecel1’ Ighe n = 9, Pool1 n = 12, Pool2 n = 13, Pool3 n = 10 , Pool4 n = 8, Pool5 n = 10, Pool6 n = 8 et Pool7 n = 9 cellules à partir de 24 souris (3 souris par pool).

Données étendues Fig. 9 La caractérisation et la validation du criblage CRISPR – Cas9 in vivo révèlent des gènes clés contribuant aux propriétés de déclenchement d’éclatement du TRN.

a , traces de rebond de rafale représentatives des neurones enregistrés après avoir éliminé différents gènes individuels de Pool3 via l’édition de gène CRISPR – Cas9. Assommer Kcnd2 récapitule les effets de la piscine n ° 3. b , tracés radar pour le gène individuel Pool3. En haut: changements dans les neurones Spp1 comme (‘Spp1’), ligne rose montrant l’effet du knock-out du gène Pool3 et les nuances de couleur s’affichent l’effet produit par knock-out de gène individuel. En bas: changements dans les neurones Ecel1 comme (‘Ecel1’), ligne verte montrant le tracé radar du gène Pool3 et nuances de couleur montrant les changements produits par knockout de gène individuel. Kcnd2 knockout récapitule étroitement l’effet de Pool3 dans les deux populations. c , Résumé du nombre maximal de sursauts de rebond des neurones TRN provoqués par des protocoles comparables après que des gènes individuels de Pool3 aient été éliminés dans Spp1 i > comme (‘Spp1’) vs Ecel1 comme (‘Ecel1’) neurones (‘Spp1’ Kcnd2, P = 0,0095. ‘Ecel1’ Kcng1, P = 0,0088; Kcnd2, P = 0,019, bilatéral non apparié t -tester). Les barres représentent la moyenne ± s.e.m. Pour a c , ‘Spp1’ Kcng1 n = 6, Kcnc3 n = 6, Kcng4 n = 5, Kcnip1 n = 7, Kcnd2 n = 7; ‘Ecel1’ Kcng1 n = 10, Kcnc3 n = 8, Kcng4 n = 9, Kcnip1 n = 11 , Kcnd2 n = 11. d , Schémas de l’analyse de l’efficacité sur cible et hors cible. En haut: organigramme d’analyse. WGA: amplification du génome entier; NGS: séquençage de nouvelle génération. En bas: schémas de conception de sgRNA et amorces pour l’analyse sur cible pour le knock-out de Kcnd2 . Cinq sgRNA ont été conçus dans Exon2, Exon3 et Exon4. Comme la longueur parcourue par le sgRNA le plus à gauche et le sgRNA le plus à droite dépasse la limite d’analyse NGS, la PCR nichée combinée au séquençage de Sanger a été utilisée pour l’analyse de l’efficacité sur la cible. Les amorces pour la PCR imbriquée sont représentées par des flèches noires dans Exon1 et Exon5. e , diagramme à barres montrant l’efficacité sur la cible (5 sgRNA regroupés) analysée par PCR imbriquée et séquençage Sanger (contrôle: n = 96 noyaux, viral injecté: n = 384 noyaux) et taux hors cible pour le haut prévu (Methods ) locus hors cible de chaque sgRNA analysé par NGS ( n = 1 600 cellules et 72 000 noyaux). Les séquences hors cible prédites sont affichées avec des bases non concordantes en minuscules. Les graphiques à barres représentent l’estimation du maximum de vraisemblance (MLE) et les intervalles de score de Wilson supérieurs, aucun point de données brutes applicable 64 ( Informations supplémentaires ).

Données étendues Fig. 10 Expression γ 6 et son effet de perturbation dans le Cellules TRN.

a , Courants calciques mesurés en contrôle (traces noires) et avec expression γ 6 (traces rouges). b , Densité de courant résumée en fonction des relations de tension montrant que γ 6 exprimant les neurones TRN présentent des densités de courant de calcium plus petites que les témoins ( P = 0,02, deux- Test t non apparié, données présentées sous forme de moyenne ± sem). Pour a , b , n = 6 neurones / 3 souris. c , d , Quantification des cellules étiquetées de manière rétrograde ( c ; P = 0,6170, ns, non significatif, deux -sided unpaired t -test) et leur pourcentage de neurones PV totaux ( d ) dans la série de coupes coronales de souris injectées. L: hémisphère gauche; R: hémisphère droit; g6: γ 6 ; FO: premier ordre; HO: ordre supérieur. Pour c , d , n = 7 pour chaque condition expérimentale, données présentées sous forme de moyenne ± s.e.m. Pour c , les tracés sont superposés avec des points de données brutes. e , Nuage de points montrant γ 6 exprimant le pourcentage et la taille de l’effet pour des souris individuelles. Rangée du haut: pourcentage de puissance delta; rangée du milieu: nombre de broches par minute dans NREM; rangée du bas: durée médiane de la période de sommeil dans NREM en secondes; points: animaux avec injection rétrograde γ 6 dans le noyau thalamique somatosensoriel FO (rouge) et HO (vert). n = 6 pour chaque condition. f , Distribution cumulative de la longueur du fuseau de sommeil pour chaque souris avec injection rétrograde γ 6 dans les noyaux thalamiques somatosensoriels FO (supérieur) et HO (inférieur), correspondant à la Fig. 5 h . g , h , Résumé de la durée médiane des épisodes de sommeil NREM avec injection rétrograde γ 6 dans FO ( g ) et les noyaux thalamiques somatosensoriels HO ( h ). À droite: test bilatéral de la somme des rangs de Wilcoxon; À gauche: test de Kolmogorov – Smirnov. Pour les données dans f h , n contrôle (FO) = 8, n i > γ6 (FO) = 8, n contrôle (HO) = 7, n γ6 (HO) = 8. Les boîtes à moustaches représentent les minima, 25e, 50e, 75e centiles, maxima.

Informations complémentaires

À propos de cet article

Citer cet article

Li, Y., Lopez-Huerta , VG, Adiconis, X. et al. Sous-réseaux distincts du noyau réticulaire thalamique. Nature (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2504-5

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